論土壤微生物的宏基因組學及其研究進展

論文類別:理學論文 > 地質學論文
論文標簽:生物教育論文 醫學微生物學論文
論文作者: 李艷艷
上傳時間:2009/9/23 17:01:00

  論文關鍵詞 土壤宏基因組學;研究進展;局限性

  論文摘要 土壤宏基因組學技術是近來發展比較迅速的一種新方法,是研究土壤微生物生態學的基礎,也是獲是土壤中各種基因資源的一種有效手段。介紹了土壤宏基因文庫的構建、筛選及土壤宏基因組研究現狀和这一技術的局限性。
  
  宏基因組學源於20世紀70年代土壤微生物基因組DNA的直接提取技術的實現,隨著微生物學和生物技術的不斷發展,Handelsman於1998年提出了宏基因組學的概念[1]。宏基因組學又叫環境基因組學(Environmental Genomics)或群體基因組學(Community Genomics),定義為利用現代基因組技術直接研究自然狀態環境中的有機体群落,而不需要分離、培養单一種類的微生物。生物學和化學的結合孕育了宏基因組学的誕生,而宏基因組學的發展需要最大限度的利用現代生物技術和實用篩選技術。
  土壤宏基因組学技術是近來發展比較迅速的一种新方法[2],這種方法從土壤環境樣品中直接提取微生物基因组DNA(宏基因組)并克隆於不同載體,再將重組载體轉移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫;同時結合不同的篩選技術,從基因文庫中篩選新基因或新的生物活性物質。應用這些免培養的新方法和新技術,可以繞過微生物菌種分離培養這一技術難關,直接在基因水平上研究、開发和利用無法培養的微生物資源;有利於揭示不可培養微生物的基因多樣性,為農業、醫藥和环境的可持續發展提供豐富的資源。
  
  1土壤宏基因文庫的構建
  
  關於土壤宏基因組學技術的構建已有許多研究報道[3],文库的構建需要足夠高質量的DNA,由於土壤微生物往往會與土壤其他組分緊密結合,這就增加了提取土壤DNA的難度[4]。常用的方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法是將样品直接懸浮在裂解緩沖液中处理,使其釋放DNA,繼而抽提純化;間接提取法是首先去除土壤等雜質,通過不同的離心速度從土壤中分離出細胞,然后對細胞進行抽提。直接提取法提取的DNA片段較小(1~50kb),提取率高,操作簡單;间接提取法提取的片斷較大(20~500kb),純度高,但操作繁琐,有些微生物在分離過程中會丟失。
  根據插入片斷大小,可以把基因文庫分成2類:質粒載體的小片段插入(小於15kb)和柯斯質粒(15~40kb)或BAC(細菌人工染色體)(超過40kb)載體的大片段插入。大腸桿菌(Escherichia coli)是表達土壤细菌基因或基因簇的通用宿主,穿梭載體或BAC文庫可將大腸桿菌包含的文库信息轉移至其他宿主如链黴菌或假單胞菌[5]。
  載體系統的選擇取決於所提取土壤DNA的質量及研究目的,包括欲插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數、使用的宿主以及篩選方法等。如對腐殖質含量較高或剪切较嚴重的DNA樣品適宜構建質粒文库,小片段的文庫適用於篩選新的與代謝相關的單基因或小操縱子;而对於含較大基因簇或大片段的DNA樣品則需要構建大片段和大容量的載體文庫。Rondon直接把環境DNA克隆到低拷貝BAC载體,以大腸桿菌作為宿主構建了含100Mbp 的小文庫(SL1),
  並從這個文庫中檢測到DNA酶、脂肪酶、澱粉水解酶的活性。
  
  2土壤宏基因組文庫的篩選
  
  宏基因文庫的篩选主要有功能驅動篩选、化合物結構水平的篩選、序列驅動篩選,底物诱導基因表達篩選。功能驅動篩選是根據重組克隆產生的新活性進行篩选,在工業上有很多重要的酶就是用這種方法發现的。其主要缺點是要在寄主中進行功能表達,造成篩選工作量大,效率低。化合物结構水平的篩選是根據不同結構的物质在色譜中有不同的峰值,通過比較轉入和未转入外源基因的宿主细胞或發酵液抽提物的色譜图篩選產生新結構化合物的克隆子。此方法工作量大,費用高。序列驅動篩選是不依賴重組基因在宿主中表達來篩選,而是根據已知功能的基因序列设計探針或PCR引物,通過雜交进行篩選具有目標序列的克隆子。底物誘導基因表達篩選是利用底物誘導克隆子分解代謝基因進行筛選,這種方法已經成功的從宏基因中篩選出芳烴化合物诱導的基因。國內外的資料显示這4種篩選方法可以筛選到所需要的物質,但篩選效率低,費用高。
  
  3土壤宏基因組研究現狀
  
  利用宏基因組學的技術,科研人員篩選到了許多功能基因,加拿大TerraGen Discover公司最先在以鏈黴菌為宿主的宏基因組文庫中篩選到了具有抗菌活性的5種新的小分子物質TerragineA、B、C、D、E[5];Courtois等利用柯斯載體構建了含5 000個克隆子的環境基因組文庫,采用PCR 序列分析的方法,篩選出編碼聚酮合成酶的新基因,同時采用HPLC技術发現了脂肪二烯醇中2種新的化合物,兩者互為同分異構體;Yun等選用pUC19为克隆載體構建大腸桿菌基因組文庫,利用活性篩選方法,從30 000個重組子中篩選出1個含澱粉酶基因(amyM)的克隆子。
  2005年,LimHK等以枯草芽孢桿菌為宿主,建立了森林土壤的宏基因組文庫,篩選到2個具有抗菌活性的克隆,對其结構進行分析,得出其中一個為產紅色色素的靛玉紅,另一個為產藍色色素的靛藍,是靛玉紅的異構體。2006年,VogetS等首次研究了從土壤宏基因組文庫中篩选到的一種纖維素酶的性質,證實了其具有較廣的pH值和溫度適應範圍,並且在較高的鹽度時也具有活性,具有工業應用價值。 免費論文下載中心 http://www.hi138.com
  4土壤宏基因組學的技術局限性
  
  總DNA提取技術尚存在一定的限制,土壤环境中,由於微生物與土壤顆粒緊密結合的特性以及腐殖酸等抑制性物質存在等原因,從中難以獲得適於構建宏基因组文庫的高分子量DNA。Bertrand等采用間接提取法,通過Nycodenz梯度離心,所回收的土壤DNA片段大小己能達到400kbp,但至今基於原位裂解獲得>100kbp土壤DNA的提取技術尚未突破,運用原位裂解法構建更大片段環境宏基因組文庫(現有的土壤宏基因組文庫中,平均插人片段最大為44.5kb)仍是一个難點。不可避免地,環境宏基因組文庫所包含微生物基因組信息的偏差將直接導致“基因遺漏”現象發生,如海洋中普遍存在的微生物固氮基因,卻在測序量高達1.6Gbp的马尾藻海水宏基因組文庫中被遺漏,表明僅運用宏基因組學技術同样會忽略部分的微生物資源。
  陽性克隆篩選頻率低是宏基因組学的另一個瓶頸所在,運用經典的功能篩選方式,往往是在數千個,甚至數百萬個重组克隆子中才能檢測到有用的活性克隆,造成此局面一個重要的原因是外源基因的異源表達水平低下。目前根據核酸序列相似性及基因保守區设計探針或引物的雜交、PCR篩選方法,從文库中發現新基因的比率尚不到已知基因的40%。
  環境微生物宏基因組研究能讓我們发現存在於不可培養微生物中的一些重要的生理過程。許多實驗室已經開始努力從不可培養土壤生物的基因組序列中去獲得重要的基因,特別是從Acidobacterium組中,因為它是土壤中最常見的細菌。這些数據提供了關於這些生物在土壤中扮演角色的線索。隨著足夠序列信息的獲得,這些生物的代謝途徑將被構建出來,引導我們采取有效的策略去培養這些生物。這些數据也將準許我們構建包含所有已知開放閱讀框的微生物芯片,來確定這些基因在時間和空間上的表達狀況。
  盡管宏基因組技術本身還存在著一些局限性,但它為土壤微生物的研究提供了一種有效的研究策略,尤其是對於99%以上不能獲得純培養的土壤微生物來說,宏基因組學不僅是研究土壤微生物生態學的堅實基礎,更是我们獲得土壤中各種基因資源的一个有效手段。
  
  5

參考文獻


  [1] HANDELSMAN J,RONDON M R,BRADY SF,et al.Molecular biological access to the chemistry of unkown soil microbes:a new frontier for natural products[J].Chen Biol,1998,5(10):245-249.
  [2] VOGET S,LEGGEWIE C,UESBCK A,et al.Prospecting for novel bicoatalysts in a soil metagenome[J].Appl.Emiron.Microbiol,2003(69):6235-6242.
  [3] RONDON MR,AVGUST PR,BETTENMANN AD,et al.Cloning the soil metagenome:a strategy for accessing the genetic and funcfional persity of uncultured microorganisms[J].Appl.Environ.Microbiol,2000(66):2541-2547.
  [4] SALEH-LAKHA S,MILLER M,CAMPBELL,RG,et al.Microbial gene expression in soil:methods,applications and challenges[J].Micro biological Methods,2005,63(1):1-19.
  [5] WANG GY,GRAZIANI E,WATERS B,et al.Novel natual products from soil DNA libraries Tn a streptonycete host[J].Org Lett,2000(2):2401-2404. 轉貼于 免費論文下載中心 http://www.hi138.com
下载论文

論文《論土壤微生物的宏基因組學及其研究進展》其它版本

地質學論文服務

網站聲明 | 聯系我們 | 網站地圖 | 論文下載地址 | 代寫論文 | 作者搜索 | 英文版 | 手機版 CopyRight@2008 - 2017 免費論文下載中心 京ICP备17062730号