陰莖海綿體平滑肌細胞的鑒定分析進展

論文類別:理學論文 > 理學相關論文
上傳時間:2010/1/8 14:52:00

           作者:陳世濤 呂伯東 黃曉軍

  論文關鍵詞:陰莖海綿體 平滑肌細胞 鑒定
  論文摘要:闡述體外培養陰莖海綿體平滑肌細胞(corpus cavernosum smooth muscle cell,CMSC)的鑒定方法。比較不同方法對於體外培養的陰莖海綿體平滑肌細胞(CMSC)的鑒定分析及其特異性,優化研究勃起功能障礙(erectile dysfunction ,ED)所需要的CMSC培養模型。
  勃起功能障礙(erectile dvsfunction,ED)是一種多因素引起的男科難治性疾病[1],嚴重影響患者的整體健康和生活質量[2]。陰莖海綿體平滑肌細胞(CSMC)是組成陰莖海綿體的主要功能成分,約占整個陰莖組織成分40%~50%,是調節陰莖勃起及維持勃起的重要因素,是陰莖神經調控的主要效應器部位[3-4] ,因此關於陰莖海綿體平滑肌細胞的研究顯得尤為重要, 而CSMC 的培養和鑒定是研究的基礎,因此CSMC純化鑒定在細胞水平上研究ED的機制頗為關註,本文就體外培養的CMSC鑒定分析做一綜述。
  1988年, Krall 等[5]首先運用體外培養的人CMSC研究了勃起相關的生化反應。此後,體外培養擴增CMSC成為ED基礎研究的重要手段[6],但尚缺乏對體外培養的CMSC的特異性鑒定方法。Granchi等[7]很早就發現成人海綿體平滑肌細胞的培養過程中很難避免成纖維細胞汙染。目前被奉為經典的Pilatz等[8]文獻報道中海綿體平滑肌細胞的培養純度也僅達到25%左右。現在鑒定CMSC的方法一般有光鏡、透射電鏡觀察、相差顯微鏡觀察、免疫組化印記法、免疫細胞化學法等[9]。
  1 CMSC的形態鑒定
  在常規染色中,第2代傳代培養的CMSC常規蘇木精、伊紅染色,顯微鏡下觀察。蘇木精伊紅染色顯微鏡顯示培養細胞胞質被染成紅色,且清晰、均勻,胞核染成藍色。另外還有一些特殊的染色方法,參照杜卓民[10]方法,標本獲取、固定同常規染色法,顯微鏡下觀察。Masson三色染色法顯示培養細胞胞質被染成紅色。VG染色顯示培養細胞胞質被染成黃色,傳代培養的細胞Masson三色染色法及VG染色細胞純度在98%以上[9]。顯微鏡做形態觀察時,觀察傳代細胞培養至第2或第3代,培養細胞制成超薄切片,透射電鏡下觀察細胞形態,觀察培養的細胞呈長梭狀、放射狀生長、成束的細胞平行排列。部分區域呈多層重疊,部分呈單層。呈現平滑肌細胞典型的峰—谷狀生長。可觀察到胞內染色質分布均勻,核仁清晰,胞內含有豐富的肌絲。使用相差顯微鏡時,可見培養細胞呈長梭型、放射狀生長,成束的細胞平行排列。部分區域細胞多層重疊,部分區域呈單層,高低起伏,呈現平滑肌細胞特征性的峰-谷狀生長[9]。
  關於形態學的鑒定方面,Lee等[11]認為顯微鏡下可以區分紡錘形的CMSC 和扁平狀的成纖維細胞 ,在熒光微鏡下觀察到α- 平滑肌肌動蛋白(α-actin)和肌球蛋白(myosin)陽性的細胞形態不一,可呈現長梭形、紡錘形及多角形等,因此單純從形態學區別CMSC和成纖維細胞並不可靠。
  2 CMSC的免疫組化鑒定
  2.1 免疫組化染色
  平滑肌細胞的鑒定主要依靠細胞形態及α-平滑肌肌動蛋白(α-actin)、肌球蛋白(myosin)、結蛋白(desmin)檢測[12]。
  2.2 平滑肌細胞形態熒光顯微鏡鑒定
  培養的平滑肌細胞經α-actin單克隆抗體免疫組織化學染色,鏡下可見梭形平滑肌細胞,淡藍色胞核及淺黃色胞質,而胞漿為淡紅色,並可見細胞內染成深黃色的肌動蛋白。海綿體SMC經血管內皮因子(F8 ) 染色呈陰性,細胞核及胞漿均表現為藍色,對照的血管平滑肌細胞經 F8 :染色呈陽性,細胞核表現為藍色、而胞漿為淡紅色。以上可以鑒定培養的細胞為CMSC [9、13]。
  2.3 α- 平滑肌肌動蛋白(α-actin)、肌球蛋白(myosin)、結蛋白(desmin)的鑒定 免費論文下載中心 http://www.hi138.com
  肌動蛋白是一種具有收縮能力的微絲蛋白在真核細胞中普遍存在,含量豐富,依其氨基酸序列和構型的不同而有不同的類型,至少存在6種亞類,其中兩種廣泛存在於肌肉與非肌肉細胞的胞漿中,稱為β和γ肌動蛋白 另外4種主要分布於肌細胞中,統稱為α-actin ,按分布的不同 ,又分為橫紋肌的α-S-actin ,心肌的α-C-actin ,血管平滑肌的α-SM-actin,胃腸道平滑肌的α-γ-actin四種。陰莖海綿體平滑肌細胞屬於α-SM-actin。平滑肌特異性的平滑肌肌動蛋白單克隆抗體進行免疫組化染色,是鑒定CMSC的特異性標記。而myosin是粗肌絲的主要組成成分,Desmin是中間絲的主要成分,都是平滑肌細胞的良好標誌 [9] 。
  陳斌等[9]用SABC法,分別用子宮肌瘤平滑肌標本作為α-actin、myosin、desmin的陽性對照,以大動脈作為Ⅷ因子陽性對照,每次實驗均以PBS代替一抗作為陰性對照。α-actin和myosin免疫組化染色顯示培養的細胞、均呈現陽,而desmin及Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色為陰性。將培養傳代的細胞移入不含血清的DMEM培養基培養後,再次做結蛋白免疫組化 ,則出現抗結蛋白免疫組化染色陽性結果,免疫組化α-actin、myosin、desmin染色陽性細胞數總體可達95%。 馮超等[14]觀察第一代細胞熒光顯微鏡下對α-actin、myosin僅有少量表達。第五代細胞對α-actin、myosin幾乎無陽性表達。經過多次貼塊培養後細胞對陽性率進一步降低。 宋魯傑等[15]熒光顯微鏡下觀察到a-actin和Myosin僅有少量表達 ,隨傳代次數的增加,細胞表達a-actin和 Myosin的陽性率進一步降低。 Abeysinghe HR等[16]得出第二代平滑肌細胞經免疫熒光檢測顯示α-actin、myosin、desmin均呈陽性反應。但後兩者的熒光強度弱於α-actin。同期制備的兔成纖維細胞僅α-actin呈現陽性反應,余下指標均顯示陰性。Giovanni等[17]報道的培養方法,培養成功後CMSC其純度通過檢測證實陽性可達α-actin可達97%。
  國內多采用α-actin單個指標作為鑒定平滑肌細胞鑒定的標準,且對抗體陽性率的計算方法沒有進行很好的闡明[12、13] ,從目前的文獻上來看α-肌動蛋白是一個非常特異性的指標。Pilatz[8]等更傾向於將結蛋白作為鑒別平滑肌細胞的特異性指標。Rajasekaran [18]還支持將α-肌動蛋白結合肌球蛋白作為鑒定平滑肌細胞的指標。Abeysinghe HR研究同期成纖維細胞在這兩項指標的檢驗中均提示陰性,並在進行流式細胞純度分析的全過程中始終低於α-肌動蛋白表達的陽性率[16],因此可以認為利用desmin結合α-actin是用來鑒別海綿體平滑肌細胞有效的指標。有趣的是,Krall等[5]曾指出結蛋白會在體外培養的時候消失,但把細胞移入不含血清的培養液中繼續培養,則又可以誘導細胞合成desmin,陳斌等[9]通過實驗得出類似的結論。 Kolodsick[19]認為成纖維細胞體外培養時有向肌纖維母細胞轉化的趨勢, 在這個過程中α-actin也是表達的,這可能是以往研究中CMSC假陽性的一個重要原因。
  3 展望
  優化CMSC培養的鑒定方法,為研究ED的細胞培養純度提供保證。但是現在各種鑒定方法特異性值得進一步商榷,其陽性率有待提高,根據CMSC和成纖維細胞細胞膜差異蛋白表達的情況,運用流式分選技術鑒定純度較高,將是今後研究的方向,另外幾種方法聯合鑒定可以提高陽性率,逐步提高細胞純化度,會促進ED病理生理機制的研究新進展,從而促進ED研究和指導臨床治療。
  

參考文獻


  [1] Jardin A.Erectile Dysfunction[M].Plymouth ; Health Publication Lid,2000.711-726.
  [2] Feldman HA,Johnnes CB,Derby CA,et al.Erectile dysfunctionand coronary risk factors:prospectiveresults from the Msachusetts male aging study[J].Prey Med,2000,30(40):328-338. 免費論文下載中心 http://www.hi138.com
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