活性炭對酥梨汁色素的吸附研究

論文類別:理學論文 > 農林學類論文
論文作者: 李玉彬 錢曉璐
上傳時間:2010/12/13 11:48:00

  摘要鏈黴菌是放線菌中非常重要的一個屬,具有廣泛的物種多樣性和代謝多樣性,它能產生多種抗生素和其他活性物質,在臨床和農業上具有廣泛的應用。但是,由於鏈黴菌普遍存在的遺傳不穩定性,大大限制了其功能的發揮。因而,除了通過新的技術手段篩選新的活性菌株,研究人員多采用對現有鏈黴菌的改造育種來實現抗生素產量的提高和穩定,或者生產新的抗生素。主要論述了鏈黴菌育種中常用的4種方法,即物理誘變、化學誘變、生物工程改造和復合誘變。同時,引證近年來鏈黴菌育種實例,對這些育種方法的作用機制進行了簡要的闡述和總結。
  關鍵詞鏈黴菌;育種方法;作用機制
  
  自從1943年Waksman首先從鏈黴菌中發現鏈黴素來,放線菌就成為抗生素、酶及其抑制劑等活性物質的重要產生菌[1]。目前已經被分離和描述的放線菌至少有180個屬,4 000多種[2]。采用傳統的方法,分離新的放線菌和新的活性物質,已經變得非常困難[3]。對已知的抗生素產生菌進行改造和育種,從而使其產生新的抗生素或使原有抗生素的產量和質量得以提升[4]已經成為各國學者研究的新熱點和方向。就鏈黴菌的育種方法進行了系統的整理,結合近幾年的育種實例,對育種方法及其作用機制進行了簡要的闡述和總結。
  
  1物理因素誘變育種
  
  物理因素誘變的方法主要包括紫外線誘變、激光輻照誘變、微波誘變、離子註入誘變和空間作用誘變等。其中,激光輻照誘變又分為He-Ne激光誘變、銅蒸汽激光誘變和快中子輻照誘變3種。
  1.1紫外線誘變
  紫外線是一種使用時間長、效果好,誘發設備簡單的誘變劑。絕大多數的高產抗生素產生菌都使用過紫外線誘變進行育種[5]。通常將放線菌制成孢子懸液,用30 W波長穩定的紫外燈在30 cm處進行照射,期間用磁力攪拌器對懸液進行攪拌,使其接受均勻。處理完成後,為防止回復突變,應暗處塗布並於黑暗培養。黃世文等[6]對淡紫色吸水鏈黴菌進行紫外線誘變後,獲得的菌株發酵液對受試菌水稻紋枯病抑菌效果較誘變前有明顯提高,同時證實了處在生長分裂初始階段的鏈黴菌對紫外線作用較敏感,易發生變異。黃永春等[7]以吸水鏈黴菌海南變種為出發菌,經連續2次紫外誘變後選育出對小麥赤黴菌有很好抑菌效果的高產菌株,菌株產抗生素能力比初始菌株提高了30.06%,且在斜面連續傳代5次後仍有穩定的遺傳性狀。李繼安等[8]將經紫外線誘變處理的博來黴素產生菌孢子塗布在含鏈黴素的培養基平板上,篩選出可抗性突變菌株,產量陽性效率達到了12.6%。
  1.2激光輻照誘變
  使用一定量的激光照射菌體,激光的能量被菌體內部的生物大分子吸收,引起分子激發光解離以及自由基反應,而引起菌體生物性狀發生改變,為優良菌種的選育提供了大量的原材料。激光輻照誘變依據其所用的激光類型不同,主要分為He-Ne激光誘變、銅蒸汽激光誘變和快中子輻照誘變3種。
  He-Ne激光對生物的誘變機制在於紅激光能提高染色體結構的機能狀態,增加有效分裂活性,使細胞處於易變狀態,通過多光子的吸收而聚積能量,並進行再分配而引起DNA分子的損傷和突變。吳振倡[9]用He-Ne激光輻照龜裂鏈黴菌高產株單孢子懸液20 min,曾獲得高產菌株5221,其發酵單位比未輻照菌株提高了5%。此外,吳振倡[10]還首次報道了應用銅蒸氣激光輻照龜裂鏈黴菌獲得高產輻照株,其產量平均提高了10%以上。發酵單位達到國際先進水平。吳振倡等[11]報導銅蒸氣激光輻照金黴素鏈黴菌30 min得到激光高產株,其發酵單位比對照提高12.5%。快中子是一種理想的誘變劑,劉路[12]利用快中子誘變潔黴素產生菌林肯鏈黴菌,使其搖瓶效價提高了17%。
  1.3微波誘變
  微波是一種電磁波,使用微波進行鏈黴菌的誘變操作簡單,安全可靠。微波能夠刺激菌體細胞內水分、蛋白質、核苷酸、碳水化合物等極性分子的快速運動,這種快速運動所引起的摩擦可以使細胞內DNA之間的氫鍵和堿基堆積力破壞,DNA結構發生改變,從而引起遺傳上的變異。塗璇等[13]通過微波作用對鏈黴菌702菌株孢子進行不同時間誘變處理,以慶大黴素為致死突變標誌,獲得了高產抗真菌活性物質的菌株,其搖瓶發酵單位提高了49.9%。郭峰等[14]以微波對南昌鏈黴菌進行了微波育種,獲得了梅嶺黴素殺菌劑生產能力高於出發菌株73%的新菌株,多次傳代後遺傳性狀保持穩定。陳力力等[15]利用微波誘變方法對井岡黴素產生菌吸水鏈黴菌井岡變種進行誘變處理,挑取單個菌落搖瓶初篩、復篩、測定化學效價,獲得的4株突變株比出發菌株分別提高了17.5%、15%、20%、21.7%。連續傳代4次,代間化學效價差異不明顯,遺傳性能穩定。由此可見,微波誘變所導致的產量變化差異較大,但遺傳性能穩定性較高,因而可以通過擴大誘變原始菌株數量,增加誘變次數等方式增加獲得理想突變株的幾率。
  1.4離子註入誘變
  離子註入是將低能的離子註入生物體內,通過復雜的能量傳遞、質量沈積和電荷交換,使染色體發生畸變[16],使裸露的單鏈和雙鏈質粒DNA發生斷裂[17],堿基發生突變[18]等。離子註入不僅可以直接引起堿基分子結構的改變,還可以參與細胞的重組和修復。具有突變率高、突變譜廣的優點,容易獲得酶活力高的突變株。劉曉秋等[19]用低能N+離子束註入轉谷氨酰胺酶產生菌氟氏鏈黴菌後,檢測到堿基發生轉換、顛換和缺失,其中胞嘧啶發生突變頻率最高。向砥等[20]利用離子註入誘變選育高產的壯觀鏈黴菌,獲得的高產菌株效價較對照提高了102.3%,可見離子註入誘變較容易獲得活力高的突變菌株。
  1.5空間作用誘變
  空間作用誘變育種是利用空間技術設備(生物衛星、航天飛機等空間飛行器)搭載微生物材料,通過外層空間特殊的物理環境的作用,如微重力、強輻射、低真空等,從而使菌種的DNA分子結構發生變異和重組,得到新的菌種。王璋、劉新征等[21]將鏈黴菌WZFF.L-M1搭載“神舟”四號飛船進行空間育種,結果篩選出5株遺傳性能穩定的菌株,產酶能力提高了30%以上。盡管空間作用誘變對於鏈黴菌的選育具有良好的效果,但是由於搭載工具造價高昂、程序復雜等因素制約,空間誘變並非主流的誘變方法。除此之外,還有60Co λ射線育種、離子束誘變育種、通電處理誘變育種等物理方法。這些誘變方法也取得了一定的誘變成果。
  
  2化學因素誘變育種
  
  化學因素誘變育種主要是指利用一系列的化學物質,如亞硝基胍、鹽酸羥胺、亞硝酸、抗生素、氯化鋰、吖啶橙等物質,對鏈黴菌進行處理,導致基因組中堿基對發生轉換、缺失和異位等,如氯化鋰可導致AT-GC堿基對發生轉換或堿基缺失,從而導致代謝途徑等發生改變,產生高產的優良菌株。當前在鏈黴菌誘變育種上應用的主要是甲基磺酸乙酯、亞硝基胍和氯化鋰。塗璇等[22]利用亞硝基胍誘變鏈黴菌702菌株,獲得的高產突變株20-29-12,產素單位比出發菌株提高了38.08%。朱非等[23]以林肯鏈黴菌947-8為出發菌株,采用孢子熱處理方法處理出發菌株孢子,後進行NTG誘變處理,得到的突變株,產林肯黴素為1 218 γ/mL,產量穩定。黃晶等[24]利用硫酸二乙酯對金黴素鏈黴菌進行誘變,菌株的正突變率達到52%。由此可見,化學誘變的效率也是非常高的,對於鏈黴菌抗生素產量的提高有非常重要的作用。
免費論文下載中心 http://www.hi138.com   3生物工程改造育種
  
  生物工程改造育種是隨著生物技術的發展,尤其是細胞生物學、分子生物學、基因扣作等學科的發展而興起的育種方式。本文主要從原生質體融合和基因工程育種2個方面對生物工程改造育種進行闡述。
  3.1原生質體融合
  微生物原生質體融合技術具有重組頻率高、受結合型或致育型限制小以及遺傳物質傳遞完整等優點。通常使用機械法或酶法去除細胞壁制備原生質體,之後在合適的條件下進行人為的誘導融合,采用營養缺陷型、抗藥性、滅活標記或熒光染色標記進行融合子的篩選。應用原生質體融合技術可以有效地提高代謝產物的產量和質量;改良菌種的遺傳特性,獲得新的代謝途徑和性狀[25]。
  原生質體融合中的關鍵環節在於原生質體的再生,劉金艷等[26]研究了玫瑰黃鏈黴菌Men-myco-93-63原生質體形成和再生條件,通過培養基選擇、培養時間、甘氨酸濃度、溶菌酶濃度、酶解時間等條件選擇和優化,成功獲得了原生質體,為轉化、基因表達奠定了基礎。王記俠等[27]運用原生質體融合技術將重寄生鏈黴菌F46與生防鏈黴菌SC1融合,篩選出的融合子對灰葡萄孢的抑制作用提高了27.99%。陳芝等[28]對2株阿維鏈黴菌(阿維菌素高產株76-05和僅產阿維菌素B不產寡黴素的基因工程菌73-12)進行了原生質體融合,選育出僅產阿維菌素B不產寡黴素的高產菌株。原生質體去除了細胞外壁,僅保留脆弱的細胞膜,因而對各種誘變因素的敏感性強,正突變率高,但是需要解決原生質體再生的條件優化。
  3.2基因工程育種
  由於產抗生素的鏈黴菌遺傳結構包括抗生素生物合成、抗生素抗性、氨基酸生物合成、色素生成和發育變化等方面的不穩定,大大制約了鏈黴菌的工業化生產。許多科研工作者將基因工程技術運用到了鏈黴菌育種之中,這包括:利用基因阻斷、敲除、替換等突變技術了解基因的功能、表達、調控,進而進行抗生素的修飾、改造;采用各種基因操作技術,使不同化合物、不同來源的基因在同一菌株中重新組合,增加代謝產物的多樣性[3];利用基因篩選程序,篩選含有特定類型化合物的基因產生菌,進而獲得了相應的次生代謝產物[29];利用基因組重排技術對出發菌株進行處理[30]等。
  基因組重排是以整個基因組為操作對象的一種DNA重排。其本質就是進行多次的原生質體的融合和再生。美國的Zhang首次提出了這一概念,並應用此技術提高了費氏鏈黴菌合成泰樂星的能力[30]。徐波等[31]人應用基因組重排育種方法篩選替考拉寧高產菌,其替考拉寧的產量從原始菌株的1 825 μ/mL提高到了3 016 μ/mL,增長了65.3%。徐波等[32]將普那黴素產生菌始旋鏈黴菌的孢子和原生質體經紫外誘變後的高產突變株進行了4輪基因組重排育種,篩選出的重排菌株普那黴素產量為832 mg/mL,比原始出發菌株提高了206%。
  通過基因組測序分析,已經發現在鏈黴菌基因組中大多數情況是生物合成基因以相近的簇形式存在[33],單拷貝可擴增因子通過速率限制不對稱交換以轉換成重復結構。組建重組子的可擴增因子和重要基因的拷貝數,也可能提高基因產物的表達量[34]。ccaR蛋白對棒狀鏈黴菌中克拉維酸的合成具有正調控作用,由ccaR基因編碼,白小佳等[35]通過增加ccaR基因劑量提高了棒狀鏈黴菌克拉維酸的產量,突變株的產酸量是出發菌株的1.54倍。
  將生物合成基因與相應的質粒載體重組,導入特定的基因工程菌,由於質粒的高拷貝,誘導表達獲得高產量的抗生素。高慧英等[36]對吸水鏈黴菌17997建立了噬菌體基因轉移系統,利用基因阻斷技術篩選出了與格爾德黴素生物合成相關基因的柯斯質粒,從而為格爾德黴素的生物合成基因簇的克隆奠定了基礎。張紅蓮等[37]從橄欖綠鏈黴菌A1中克隆出了木聚糖酶基因xynA,將其與大腸桿菌表達載體pET-22b(+)構建重組子,在重組大腸桿菌中木聚糖酶得到表達,搖瓶培養的表達量達到200 mg/L。隨著生物技術的不斷發展與進步,尤其是DNA體外重組技術、各種基因工程表達宿主和表達載體的構建和完善,對於鏈黴菌功能基因的研究越來越深入,功能基因的合成,基因工程菌的改造正逐漸在育種領域發揮出巨大的作用與潛力,逐漸成為鏈黴菌育種的主流方式。
  
  4復合誘變育種
  
  復合誘變育種是指采用2種或者2種以上的方式進行誘變育種。通過不同的方式作用於微生物菌株的協同效應,可以改變菌株的突變率,從而提高獲得理想菌種的幾率。通常采用物理方式、化學方式和生物工程育種兩兩結合或三者同時運用。
  余明潔等[38]以白色鏈黴菌SA為出發菌株,采用紫外照射復合氯化鋰誘變選育及亞硝酸誘變選育,得到1株具有遺傳標記AEC的抗性突變高產菌株,搖瓶發酵培養ξ-聚賴氨酸產量高達1.64 g/L,較出發菌株提高了57.7%。張建勇等[39]篩選出1株產抗腫瘤活性新抗生素AGPM的藤黃灰鏈黴菌,經過紫外單因子誘變,紫外線加氯化鋰復合誘變等2種誘變方式處理後,AGPM的產量達到18.7 μg/mL,較出發菌株提高了1.2倍。研究還發現,孢子經氯化鋰浸泡後,對紫外線的敏感性明顯增加,可能是因為氯化鋰本身並沒有誘變作用,但是復合育種過程中與其他誘變因子具有協同作用,從而導致突變率的增加。
  由於不同方式的誘變對鏈黴菌的DNA作用位點和作用方式的差異,反復使用同種類型的誘變方法可能會出現鈍化現象,從而導致鏈黴菌的回復突變,影響育種效果。因而在鏈黴菌育種過程中,要盡可能地采用新的育種方式或多種不同的育種方式進行,以提高成功的可能性。
  
  5結語
  
  物理因素誘變育種、化學誘變育種、生物工程育種,反映出鏈黴菌育種方法隨著科學進步而不斷發展的歷史。物理和化學誘變育種,雖然有一定的弊端,比如說樣本量巨大、篩選過程繁瑣等,但是同樣具有簡單、易行、安全、遺傳穩定的優點,仍然是鏈黴菌育種中不可或缺的育種方法。如采用物理化學因子對原始菌株進行誘變處理後篩選耐藥性突變株,通過搖瓶發酵復篩可以選擇高產菌株,從而達到淘汰野生型菌株、富集突變型菌株的目的,大大減輕了初篩的工作量,有效地提高了工作效率。生物工程育種則代表這鏈黴菌育種的發展方向,隨著生物學的發展,遺傳重組育種、基因表達調控育種、基因工程育種應運而生,並逐漸成為鏈黴菌育種工程的主流方法。
  復合誘變育種,則更多的體現了將各種育種方法進行有機的結合,從而實現有效的互補,最大限度的發揮育種的優勢。生物工程育種中,抗性基因、生物合成基因、功能基因的克隆和改造能夠直接大幅度的提高抗生素的產量,結合物理和化學誘變方法,獲得遺傳穩定的高產菌株,對鏈黴素工業化生產起著舉足輕重的作用。
  在現有階段,充分發展生物工程育種,發揮復合誘變育種的組合優勢,同時不斷開發新的育種方法,已經成為鏈黴菌育種的發展趨勢。隨著相關學科的不斷發展與進步,鏈黴菌育種方法將會越來越完善。
  
  6

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