相關序列擴增多態(SRAP)在農作物遺傳育種中的應用

論文類別:理學論文 > 農林學類論文
論文作者: 張婷 劉雙青 呂明治
上傳時間:2010/12/19 16:30:00

  摘要:相關序列擴增多態(SRAP)是近幾年發展起來的新型分子標記技術,具有簡便、穩定、高共顯性、易於得到選擇條帶序列等優點。闡述了SRAP的原理和流程,論述了SRAP在作物遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性、基因定位等方面的研究進展及應用前景。
  關鍵詞:相關序列擴增多態;原理;遺傳圖譜;遺傳多樣性;基因定位

  AbstractSequence-Related Amplified Polymorphism(SRAP) is a new kind of DNA molecular markers,which possesses characteristics such as simplicity,reliability,high co-dominance and easily getting sequence of selected bands. SRAP principles and protocols were described and its research advances and application in such aspects as genetic mapping,genetic persity,gene tagging and so on were overviewed.
  Key wordsSequence-Related Amplified Polymorphism;principles;genetic mapping;genetic persity;gene tagging
  
  我國有豐富的農作物品種,但天然品種總是在某些性質方面存在缺陷,如容易受到病蟲害感染、產量低等。因此,選育和推廣優質的農作物新品種是農作物研究的重要任務。分子標記輔助育種是利用分子遺傳標記,借助於目標基因緊密連鎖的遺傳標記的基因型分析鑒定含有目標基因的個體,從而提高選擇效率,減少盲目性,加速育種進程,在一定程度上彌補了傳統育種缺陷[1]。
  目前,用於植物基因組分析的分子標記有RFLP(restr-ication fragment length polymorphism,限制性片段長度多態性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA,隨機擴增多態性DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism,擴增片段長度多態性)、SSR(simple sequence repeat,簡單重復序列)、SRAP(sequence-related amplified polymorphism,相關序列擴增多態)等。其中RFLP標記雖然以共顯性方式遺傳,但由於它對DNA需求量大、實驗操作較繁瑣、檢測周期長、成本費用高等限制了其廣泛引用;RAPD方法雖然簡單易行,需DNA量極少,但由於RAPD標記是一個顯性標記,不能識別純合子和雜合子,且其操作重復性較差;SSR具有高度的多態性、共顯性遺傳、選擇中性、易於操作等優點,但SSR座位的篩選和特異引物的開發工作繁瑣且耗時費力,限制了其廣泛應用;AFLP技術發揮了檢測位點多、多態水平高、靈敏度高、結果穩定可靠等優點,但其操作要求嚴格,擴增時會有假陽性和假陰性結果以及凝膠背景雜亂等缺點,在一定程度上影響了其標記作用的良好發揮;而SRAP是一種新型的基於PCR的標記技術,它的特點在於不需要知道任何基因的序列信息即可進行PCR擴增,集中了上述幾種標記技術的優點,具有共顯性、簡便、穩定、操作簡單、重復性強、中等產率等優點,可以彌補以上各項技術的不足,在多種植物研究中得到了廣泛的應用,體現了SRAP標記技術在植物研究中的可行性。
  1SRAP標記簡介
  SRAP標記是由美國加州大學作物系Li[2]於2001年在研究蕓薹作物時開發出來的一種標記技術,在油菜、水稻、小麥、棉花等農作物上的研究已體現出一定的應用價值[3-7]。
  1.1SRAP標記原理
  SRAP主要對植物基因組中ORFs(open reading frames,開放閱讀框)進行擴增,利用外顯子富含GC而啟動子、內含子富含AT的特點設計引物。上遊引物(也叫正向引物,forward primer)長17 bp,引物的3′端為3個選擇堿基,引物的5′端為14 bp的核心序列,由一段填充序列和CCGG構成,主要結合在外顯子區域,對外顯子進行特異擴增。下遊引物(也叫反向引物,reverse primer)長18 bp,引物的3′端仍為3個選擇堿基,引物的5′端為14 bp的核心序列,其中核心序列前11 bp是一段填充序列,緊接著是AATT,下遊引物的結合位點在內含子區域或啟動子區域,對內含子區域、啟動子區域進行特異擴增。由於內含子、啟動子與間隔序列長度在物種間或同一物種的不同個體間是不等的,因此用SRAP分析時會產生多態性[2]。
  1.2DNA擴增
  DNA擴增采用復性變溫法擴增,主要是為了保證引物與靶DNA配對,並且保證擴增片段的重復性。反應體系中包括DNA 150 ng、dNTPs 0.2 mmoL/L、1.5 mmoL/L MgCl2、0.3 μmoL/L引物、1 U TaqDNA聚合酶。反應參數:94 ℃預變性5 min;循環30次,前5次循環:95 ℃變性30 s,35 ℃復性30 s,72 ℃延伸30 s;後25次循環:94 ℃變性30 s,50 ℃復性30 s,72 ℃延伸30 s,循環結束後72 ℃延伸7 min[8]。不同的物種進行SRAP-PCR擴增的最優條件並非相同,因此在進行具體研究時應對PCR中反應體系進行優化,對相關參數做濃度梯度研究以確定研究對象的最優擴增條件,達到最好的反應效果[9]。
  1.3產物檢測
  擴增產物通常用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,也可用瓊脂糖檢測多態性。分離完畢後用放射自顯影方法、銀染方法或EB方法檢測[8]。
  2SRAP技術在農作物遺傳育種中的應用
  近年來,由於SRAP引物的大量開發,並且在分子標記輔助育種中體現出了優於AFLP、ISSR、RAPD等特點[10-11],因此備受遺傳育種學家的青睞,被廣泛應用於農作物遺傳多樣性評價、遺傳圖譜構建和品種鑒定等方面。
免費論文下載中心 http://www.hi138.com   2.1遺傳多樣性研究
  遺傳多樣性是指物種中不同個體遺傳變異的總和。遺傳多樣性的研究是植物種質資源保護、品種改良和開發利用的基礎。分析種質資源的遺產多樣性,探討遺傳基礎和親緣關系,為種質資源的利用提供理論基礎。何鳳發等[12]隨機選用了27對SRAP引物對44份馬鈴薯(Solanum tubero-sum)資源進行遺傳多樣性分析,有23對引物可產生104條多態性條帶,平均每對引物產生4.5個多態性條帶,表明SRAP標記有較高的多態性比率,多態性豐富,可用於馬鈴薯遺傳多樣性的分析。李曉慧等[13]采用SRAP分子標記對西瓜(Citrullus lanatus)進行遺傳多樣性分析,8對引物組合共產生多態性條帶37條,平均4.7條,每對引物平均多態性比率為28.675%,結果表明SRAP標記具有較高的多態性,適合於分析西瓜等遺傳差異小的物種。
  2.2標定基因
  標定基因對於後基因組學的研究和作物育種具有重要意義。育種工作的目的就是實現品種改良,品種改良的實質就是對目的基因進行選擇並實現優異基因集成的過程。因而實現目的基因的快速定位、提高其選擇效率,是加快育種進程的關鍵。農作物的一些重要性狀都是由一個或多個基因決定的。如果能夠找到與目的性狀相關聯的基因或是找到與目的基因連鎖的分子標記,在雜交育種時就可以有目的地選擇親本,並且對於子代可以快速地鑒定,提高育種效率。在甘藍型油菜(Brassica napus)的育種過程中,選擇黃色籽粒是一個重要的任務。Fu等[14]利用SRAP分子標記對在不同環境中生長的2個重組品系的雜交品種進行分析,發現了19個數量相關性狀基因,其中一個主要的基因與標記EM11ME20/200相鄰,通過比較基因組學分析發現這個重要的QTL基因兩側的標記序列與擬南芥第5條染色體中定位於At5g44440基因和At5g49640基因間的一個重要的QTL基因的兩側序列有高度的同源性。
  產量性狀是復雜的數量性狀,對油菜產量性狀進行分析,可確定其在染色體上的位置及其遺傳效應,可以探討油菜雜種優勢產生原因,提高育種中對產量性狀優良基因型選擇的效率。Chen等[15]對油菜的雙單倍體群體和F2群體進行SRAP分析,發現了與6個生產性狀相關的QTL基因,包括植株高度、最低有效分枝的高度、主花序長度、角果長度、有效分枝數和角果密度,在某些染色體的區域中有多個性狀的QTL,與觀察到的部分表型性狀的相關性是一致的,表明QTLs的緊密連鎖是相關性遺傳的基礎。燕麥是人們常用的谷物,但是現在在谷物生長的土壤中經常會含有一些重金屬物質,如鎘。鎘是非必需的重金屬,在低濃度時對細胞就是高毒性的,而植物自身有一套機制可以負責鎘的解毒,並控制鎘的含量,但是對於同一種植物的不同品種可能由於遺傳因素的原因,它們的鎘含量是有差異的,因此培育低鎘含量的植物是育種的重要目標,試圖找到與低鎘含量連鎖的分子標記,作為表型選擇的依據。在對燕麥(Avena sativa)的分析中運用混合群分離分析,發現了4個與鎘含量相關的分子標記:1個SRAP,2個RAPDs,1個REMAP,這4個標記同屬於一個連鎖群,代表著與谷物鎘含量密切相關的質量性狀位點[16]。
  2.3構建遺傳圖譜
  遺傳圖譜是確定基因或DNA標誌在染色體上的相對位置和遺傳距離,是研究基因組遺傳與變異的重要手段。衡量遺傳圖譜質量的一個重要標準是標記分布的均勻程度,而標記類型是影響連鎖群上的標記均勻分布與否的重要因素之一。李媛媛等[17]利用SRAP、SSR和AFLP 3種分子標記技術對甘藍型油菜進行遺傳分析,構建了1張包含21個連鎖群的遺傳圖譜,其中涉及137個SRAP標記、143個SSR標記和118個AFLP標記,圖譜長1949.8 cM。在此研究中,雖然SSR和SRAP標記在圖譜上呈間隔分布,並且在所有21條連鎖群上,僅N7連鎖群上的標記分布不均勻,但SSR標記僅分布於非編碼區,並且開發費時費力;AFLP標記與SRAP標記相比,AFLP標記操作復雜,需要經過酶切、連接等步驟,成本較高,並且AFLP容易密集分布,在研究中約有1/2的AFLP標記僅分布在4條連鎖群上。因此,相比之下SRAP更適合於圖譜構建。Sun等[18]利用1 634對SRAP引物組合對雙單倍體甘藍型油菜群體作圖,共產生了13 551條SRAP條帶,構建的遺傳圖譜中基本上每1 cM就有8.45個SRAPs,比物理圖譜中每100 kb出現1個標記的頻率更高,是一張高密度的遺傳圖譜,這表明單一的SRAP標記對構建遺傳圖譜是適合的。
  2.4品種鑒定
  由於育種工作的大力推廣與開展,幾乎每個農作物中都培育了很多品種,有些品種從形態上看較為相似,並且也存在同物不同名的現象。為了有效地區分這些品種就必須建立分子鑒別機制。王燕等[19]利用15個引物組合對番茄(Cyphomandra betacea)11個主要品種以及1個近緣野生種進行種質鑒定的SRAP分析,雙引物組合me8/em8-1與me6-1/em14-1可以區分所有供試材料,表明SRAP可有效用於番茄品種資源鑒定。Hao等[20]利用24對SRAP引物組合對芍藥屬(Paeonia)的29份栽培品種進行研究,這29份品種分別屬於不同組,有14個為芍藥組植株,有13個為牡丹組植株,還有2個芍藥組和牡丹組的雜交植株,擴增共產生了197條帶,其中187條多態性條帶。擴增條帶結果顯示,用獨特的擴增條帶和特殊的引物組合鑒定芍藥栽培品種是有效的,可以用35條SRAP條帶把14個芍藥栽培品種兩兩相互區分,並且還通過Me8/Em8和Me8/Em1這2對引物組合把芍藥和牡丹樣品全部分離。
  3展望
  綜上可以看出,SRAP標記已被應用到農作物研究的很多領域,是一種簡單有效的分子標記。與其他分子標記相比,由於SRAP標記擴增對象是基因組中的開放閱讀框,可以體現開放閱讀框區域的多態性,也可更好地解釋物種性(下轉第82頁)
  (上接第80頁)
  狀差異的原因。對研究中獲得的SRAP差異片段可以測序,把它轉化成SCAR(sequence characterized amplified region)標記,這將更加有利於種質資源的篩選鑒定工作。總之,相信隨著檢測手段的精確度不斷提高和分析方法的逐步改進,SRAP標記會更加完善、更為廣泛地用於物種分子遺傳水平的研究。
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