農獸藥多殘留免疫分析檢測方法研究進展

論文類別:理學論文 > 農林學類論文
上傳時間:2010/12/21 11:16:00

           作者:謝桂勉 沈玉棟 孫遠明

  摘要:綜述了免疫分析法在擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯、有機磷、氟喹諾酮、磺胺5種農獸藥多殘留檢測上的應用情況,著重討論了抗原設計、抗體制備和方法建立等核心技術的研究進展,並對檢測方法的發展進行了展望。
  關鍵詞:農獸藥;多殘留;免疫分析法
  AbstractThe applications of immunoassay methods in the multi-residue determination of pyrethroids,carbamate,organophosphorus,fluoroquinolones and sulfonamides were summarized in this paper. The study advancers on core techniques,such as antigen design,antibody production and method development,were discussed emphatically,and the further trend of immunoassay methods was proposed.
  Key wordspesticides and veterinary drugs;multi-residue;immunoassay
  
  農獸藥殘留危害人們的生活健康,是食品安全檢測的關註焦點。基於特異性抗體的酶免疫分析方法作為一種簡便、快速和靈敏的檢測方法,在近年來的食品安全檢測中起到越來越重要的作用。采用酶免疫試劑盒、膠體金試紙條高通量、快速篩選陽性樣品後,再用儀器確證的方法得到檢驗監測單位的普遍認可。已成功應用的檢測產品有克倫特羅、萊克多巴胺試劑盒和試紙條等。其他如孔雀石綠、蘇丹紅、呋喃西林、恩諾沙星等快速檢測產品也已投放市場,推廣使用還需要一定時間的驗證。然而一個不爭的事實就是,對於檢測如磺胺類、氟喹諾酮類、有機磷類、擬除蟲菊酯類等有害物質時,使用單殘留試劑盒並不比直接使用儀器具有優勢。特別是檢測農殘的快速檢測產品目前還不成熟,穩定性和假陽性等問題還未能很好解決。因此,如何同時檢測一類藥物,真正降低檢測成本,並保證檢測的準確性是目前農獸藥的快速多殘留檢測的一種新趨勢。
  實現一類藥物的多殘留檢測的基本思路是針對一類藥物的共性結構設計並合成半抗原,由半抗原偶聯載體蛋白制備全抗原,通過免疫動物制備抗體,利用抗體對一類藥物的識別作用,建立多殘留檢測酶免疫分析方法[1-3]。
  1農獸藥的多殘留現狀
  近年來,食品安全問題一直是困擾民生的焦點問題,而農獸藥殘留是制約食品安全的首要因素。2000年開始,廣東省開展食品本底水平和汙染監測項目,截至2005年的監測結果顯示:蔬菜甲胺磷、敵百蟲和敵敵畏檢出率分別為7.95%、3.03%和2.65%,水果有機磷農藥水胺硫磷檢出率為10%,新鮮食用菌有機磷農藥內吸磷檢出率為8.33%,茶葉有機磷農藥三氯殺蟎醇檢出率為5%,蔬菜氨基甲酸酯農藥和擬除蟲菊酯農藥殘留檢出率為1.47%、17.17%,水果擬除蟲菊酯農藥檢出率為20%。盡管國家加強了農藥使用的監控力度,但是農藥中毒事件和對外貿易摩擦仍時有發生。2008年1—2月,中日貿易過程中發生的“毒餃子”事件(有機磷農藥中毒事件),使中國食品在日本市場遭受重創。而獸藥方面主要是一些抗生素和興奮劑的危害,如磺胺類、氟喹諾酮類、腎上腺素興奮劑等。直到2009年2月初,廣東仍有瘦肉精中毒事件發生,導致6~10人中毒。2009年6月1日,中華人民共和國食品安全法正式實施,表明了國家維護食品安全的力度。有了法律法規的約束作用,仍然不可缺少檢測方法的支持。針對目前農獸藥品種繁多,多殘留現狀嚴峻,開展多殘留檢測研究,尤其是能實現快速、高通量、現場篩查的免疫分析法的研究非常重要。
  2免疫分析法在各類農獸藥多殘留檢測上的應用
  農獸藥多殘留酶免疫分析法的基本原理是根據待測一類藥物的共性結構或共有結構特征,設計並合成突出其結構特征的半抗原,半抗原偶聯大分子蛋白質作為全抗原並免疫動物,通過細胞融合獲得雜交瘤細胞,收集並純化雜交瘤細胞分泌的類特異性抗體(或稱寬譜特異性抗體、廣譜特異性抗體),利用抗體建立酶免疫吸附測定(ELISA)、免疫膠體金(GICA)等免疫分析法。
  2.1擬除蟲菊酯
  擬除蟲菊酯(Pyrethroids)農藥是20世紀70年代研發的一類仿生殺蟲劑,具有化學性質穩定,不易光解,無特殊臭味及安全系數高,使用濃度低,觸殺作用強,滅蟲速度快等優點。目前其酶免疫分析檢測方法的研究已經開展比較多。Pullen等[4]直接采用氯菊酯的水解產物氯菊酸作半抗原,分別制備了具有不同交叉反應率的單克隆抗體和多克隆抗體,初步探索了2種抗體的類特異性。結果發現單克隆抗體可檢測類型Ⅰ(菊酯類)擬除蟲菊酯,對類型Ⅱ擬除蟲菊酯(氰菊酯)沒有交叉反應;而多克隆抗體既可檢測類型Ⅰ擬除蟲菊酯,又可檢測類型Ⅱ擬除蟲菊酯。Mak等[5]利用菊酸和間苯氧基芐醇合成的半抗原與甲狀腺球蛋白結合制備Ⅱ型菊酯的免疫原並免疫動物獲得多克隆抗體。由該抗體建立的ELISA方法檢測氯氰菊酯、百樹菊酯、氨氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的IC50值為6~205 ng/mL,而對Ⅰ型菊酯無交叉反應。國內在這方面的研究包括有李誌茹[6]、駱愛蘭等[7]、楊挺等[8]、祝金鳳[9]的報道。其中祝金鳳設計合成了能模擬Ⅱ型菊酯類農藥特征結構的半抗原(RS)-α氰基-3-苯氧基芐基(RS)-cis,trans-2,2-二甲基-3-羧基-環丙烷羧酸酯,用活潑酯法制備人工抗原,免疫新西蘭大白兔獲得抗Ⅱ型菊酯類農藥的廣譜特異性抗體。該抗體對5種Ⅱ型菊酯有識別作用,對氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯的靈敏度較高,間接競爭ELISA方法的檢測限分別為11.7 ng/mL和48.5 ng/mL。
  2.2氨基甲酸酯

免費論文下載中心 http://www.hi138.com   氨基甲酸酯類農藥(Carbamate)具有殺蟲譜廣、用藥量少、藥效快等特點,目前對其檢測主要采用高效液相色譜法和酶抑制法等,酶免疫多殘留檢測的研究報道很少。孫覃[10]合成了半抗原6-(苯氧基羰基)氨基-1-己酸並成功制備了芳基-N-甲基氨基甲酸酯類殺蟲劑的通用抗體,抗體檢測混滅威、滅除威、滅殺威、甲萘威的IC50值為0.47、0.65、1.08、0.53 μg/mL,其中混滅威在自來水、土壤以及青菜中的添加回收率分別為101.6%、87.7%和90.4%。
  2.3有機磷
  有機磷農藥(Organophosphorus)通常是指磷(膦)酸酯、硫逐磷酸酯、磷酰胺酯類有機磷化合物。對於有機磷農藥的多殘留檢測通常采用的是制備類識別特異性的抗體的途徑。已有的報道都是針對二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯兩大類有機磷農藥的研究。自從1988年Sudi等[11],首先提出建立有機磷農藥多殘留檢測的酶聯免疫的方法後,國內外已有不少利用類特異性多克隆抗體建立二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯兩大類有機磷多殘留檢測的報道[12-17]。Jang等[18]制備了O,O-二乙基-O-(5-羧基-2-氟苯基)硫代磷酰酯作為通用半抗原,偶聯蛋白質作為人工抗原免疫小鼠,通過細胞融合體外培養雜交瘤細胞,獲得單克隆抗體,並首次利用單克隆抗體建立了間接競爭ELISA的方法用於有機磷多殘留檢測是一個突破。該方法對4種含有二乙氧基有機磷農藥的IC50值在0.1~0.3 μg/mL,克服了利用多克隆抗體建立的方法特異性較差的困難。梁穎等[19]設計了3個含二甲氧基二硫代磷酸酯共有結構的半抗原,制備出3個單克隆抗體,並建立ELISA方法,檢測馬拉硫磷、樂果、亞胺硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷可以達到限量標準,印證了Jang 采用單克隆抗體建立多殘留檢測方法的可行性。同時,還首次作了實際樣品的檢測,探討了異源包被原對提高檢測靈敏度的作用。
  2.4氟喹諾酮
  氟喹諾酮(Fluoroquinolones)類藥物是一系列新型氟取代的喹諾酮類衍生物,廣泛用於畜禽和水產養殖業。由於該類藥物本身帶有羧基活性基團,方便於酶免疫分析方法的應用。蔡勤仁等[20]利用碳二亞胺法合成恩諾沙星人工抗原,免疫BALB/c小鼠並采用雜交瘤技術制備了類特異性單克隆抗體,與恩諾沙星、環丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、達氟沙星的交叉反應率為27.4%~110.8%,檢測限為0.13 ng/mL。魏東[21]利用活潑酯法制備了沙拉沙星人工抗原,免疫動物得到抗血清,並建立FQNS多殘留檢測方法。該方法對沙拉沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的檢測限為19.1~26.2 ng/mL。兔肉中4個藥物在0.5~2 000.0 ng/mL範圍內的平均添加回收率為85%。李振華[22]采用達氟沙星偶聯牛血清蛋白的人工抗原制備的兔多克隆抗體能識別達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星,交叉反應率為22.7%~111.2%。王戰輝等[23]采用環丙沙星直接偶聯牛血清蛋白作為免疫原免疫動物並制備得到寬譜特異性抗體單克隆抗體,該抗體建立的方法檢測12個氟喹諾酮的交叉反應率在35%~100%,最低檢測限都可以達到最高限量檢測要求。
  2.5磺胺
  磺胺(Sulfonamides)類藥物是一類具有廣譜抗菌活性的化學品,廣泛應用與人和動物細菌性疾病的治療和預防。該類藥物的酶免疫多殘留檢測分析研究已經比較多。1991年,Sheth等[24]用化學方法合成了3種具有磺胺母核結構的半抗原TS、CS、NS,以磺胺噻唑衍生物TS偶聯蛋白作為免疫原,制備了廣譜特異性抗體。Muldoon等[25]以對氨基苯磺酸作為半抗原偶聯載體蛋白後免疫動物,通過雜交瘤技術制備的單克隆抗體能很好識別遊離藥物,檢測磺胺硝苯、磺胺吡啶、磺胺噻唑的IC50值分別為1.41、22.80、322.00 ng/mL。ZHANG Hong-yan等[26]等設計並合成了5個對氨基苯磺酸衍生物作為半抗原,其中用對氨基苯甲酸作為手臂的半抗原偶聯KLH後免疫新西蘭大白兔得到的抗體最佳。利用其建立的異源直接競爭ELISA方法檢測11個磺胺類藥物的IC50值均小於100 ng/mL,其中磺胺異唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺吡啶和磺胺甲噻二唑可以滿足最高殘留限量的要求,牛奶樣品中藥物的添加回收率為104%~131%。呂芳[27]以含五元雜環的磺胺類藥物為研究對象,制備了族特異性單克隆抗體,建立的間接競爭ELISA方法,檢測磺胺噻唑、酞磺胺噻唑、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺甲噁唑及四者等濃度混合物的檢測限分別為14.40、6.30、18.20、33.90、4.63 ng/mL。
  3展望
  目前,農獸藥多殘留免疫分析法的應用仍處於不成熟的階段。限制其使用的因素,一是抗藥物抗體的類特異性,二是免疫分析法本身的穩定性和靈敏度。前者是開發農獸藥多殘留免疫分析法的關鍵。目前的研究成果往往存在抗體譜寬足夠但特異性不強或譜寬較窄但特異性較好的情況,真正能達到譜寬合適且特異性較好、檢測一類藥物的靈敏度相對一致的成果極少。而後者,檢測方法的穩定性和靈敏度,是開發相應檢測試劑盒產品的制約因素。目前的研究主要集中在制備類特異性抗體的層面上,涉及檢測方法和試劑盒開發的研究較少。試劑盒的開發可見於一些專利,市面上銷售的試劑盒極少,更多的是處於實驗室研究階段。
  盡管農獸藥多殘留免疫分析法仍不成熟,但作為低成本、高通量、快速檢測的一種檢測方法,適應全面保證大眾食品安全的時代需要,加上國家在這方面的投入,該方法有良好的發展前景。實際上,對於上述的限制因素已有一些研究報道[25-28]。對於抗體的類特異性,筆者認為:一是可以結合計算機模擬[29~30]等手段設計突出檢測對象共性結構的半抗原,二是可以考慮用自制的樹枝狀大分子骨架定點、定量連接半抗原構成全抗原。結合這兩者可以有針對性的設計合理的抗原,並使用這些抗原制備多克隆抗體或單克隆抗體。後續通過試驗比較抗體的抗藥物譜寬和特異性,選擇譜寬和特異性都較佳的抗體用於檢測方法的建立和檢測產品的開發。對於檢測方法的穩定性和靈敏度,筆者認為可以借鑒開發成功的單殘留檢測試劑盒的緩沖溶液體系,同時考慮多個藥物提取液的優化問題以提高檢測方法的穩定性;而靈敏度方面可以結合納米技術,如量子點技術的應用,使檢測靈敏度有數量級的提高。
  4

參考文獻


  [1] BRUUN L,KOCH C,JAKOBSEN M H,et al. Characterization of mono-clonal antibodies raised against different structures belonging to the s-triazine group of herbicides[J]. Analytica Chimica Acta,2001,436(1):87-101.
  [2] BEIER R C,LAURA H R,COLIN R Y,et al. Production,character-ization and cross)reactivity studies of monoclonal antibodies against the coccidiostat nicarbazin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(10):4542-4552.
免費論文下載中心 http://www.hi138.com

  [3] BASTA P V,ADCOCK A F,TALLENT C R,et al. Preparation of monocl-onal antibodies reactive to the endogenous small molecule,anandamide[J]. Journal of Immunological Methods,2004,285(2):181-195.
  [4] PULLEN S,HOCK B. Development of enzyme immunoassays for the detection of pyrethroid insecticides 2 polyclonal antibodies for pyre)throid insecticides[J]. Nalytical Letters,1995,28(5):781-795.
  [5] MAK S K,SHAN G M,LEE H J,et al. Development of a class selective immunoassay for the type II pyrethroid insectides[J]. Analytica Chimica Acta,2005(534):109-120.
  [6] 李誌茹.擬除蟲菊酯類農藥通用抗體制備及高效氯氟氰菊酯免疫檢測技術研究[D].南京:南京農業大學,2004:1-30.
  [7] 駱愛蘭,余向陽,張存政,等.擬除蟲菊酯類農藥多殘留酶免疫分析方法的建立[J].中國農業科學,2005,38(2):308-312.
  [8] 楊挺,皇甫偉國,謝顯傳.擬除蟲菊酯類農藥多殘留的IC)ELISA檢測方法研究[J].食品科技,2008,33(12):291-294.
  [9] 祝金鳳.Ⅱ型菊酯類農藥廣譜特異性抗體的制備和多殘留免疫技術建立[D].揚州:揚州大學,2008:1-32.
  [10] 孫覃.芳基)N)甲基氨基甲酸酯類殺蟲劑多殘留免疫檢測方法的建立與應用[D].南京:南京農業大學,2007:1-25.
  [11] SUDI J,HEESCHEN W. Studies on the Development of an Immuno-assay for the Group)specific detection of the Diethyl Ester of Phosph-ates,Thiophosphates,Dithiophosphates and Phosphonates[J]. Kiel Mil-chwirtsch Forschungsber,1988(40):179-203.
  [12] BANKS J N,CHAUDHRY M Q,MATTHEWS W A,et al. Production and charcterisation of polyclonal antibodies to the common moiety of some organophosphorous pesticides and development of a generic type ELISA[J]. Food and Agricultural Immunology,1998,10(4):349-361.
  [13] JOHNSON J C,VAN EMON J M,PULLMAN D R,et al. Development and Evaluation of Antisera for Detection of the O,O)Diethyl Phosphorot-hionate and Phosphorothionothiolate Organophosphorus Pesticides by Immunoassay[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(8):3116-3123.
  [14] COLIN M W,ANDREW P W,HEATHER A L,et al. Monoclonal anti)idio) type antibody mimicking the pesticide binding site of cutinase:potential for broad specificity organophosphate recognilion[J]. Joarnal of Imm-unological Mechods,1999(224):197-202.
  [15] ALCOCER M J C,DILLON P P,MANNING B M,et al. Use of phospho-nic acid as a generic hapten in the production of broad specificity anti)organophosphate pesticide antibody[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(6):2228-2233.
  [16] 韓麗君.有機磷農藥的酶免疫化學研究[D].北京:中國農業大學,2003:1-35.
  [17] 劉賢進,嚴春榮,劉媛,等.有機磷殺蟲劑通用結構半抗原的設計及廣譜特異性抗體的制備[J].中國農業科學,2008,41(3):727-733.
  [18] JANG M S,LEE S J,XUE X P,et al. Production and Characterization of Monoclonal Antibodies to a Generic Hapten for Class)Specific Deter-mination of Organophosphorus Pesticides[J].Bulletin of the Korean Chemical Society,2002,23(8):1116-1121.
  [19] LIANG Y,LIU X J,LIU Y,et al.Synthesis of three haptens for the class)specific immunoassay of O,O)dimethyl organophosphorus pesticides and effect of hapten heterology on immunoassay sensitivity[J].Analytica Chimica Acta,2008,615(2):174-183.
  [20] 蔡勤仁,曾振靈,楊桂香,等.恩諾沙星單克隆抗體的制備及鑒定[J].中國農業科學,2004,37(7):1060-1064.
  [21] 魏東.氟喹諾酮類藥物殘留免疫學檢測方法的研究[D].長春:吉林大學,2007:1-66.
  [22] 李振華.氟喹諾酮類藥物的篩選及達氟沙星間接競爭ELISA檢測方法的建立[D].烏魯木齊:新疆農業大學,2007:1-46.
  [23] WANG Z H,ZHU Y,DING S Y,et al. Development of a Monoclonal Ant-ibody)Based Broad)Specificity ELISA for Fluoroquinolone Antibiotics in Foods and Molecular Modeling Studies of Cross)Reactive Compounds[J]. Analytical Chemistry,2007,79(12):4471-4483.
  [24] SHETH H B,SPOMS P. Development of a single ELISA for detection of sulfonamides[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1991(39):1696-1700.
  [25] MULDOON M T,FONT I A,BEIER R C,et al. Development of a cross)reactive monoclonal antibody to sulfonamide antibiotics:evidence for structural conformation)selective hapten recognition[J].Food and agric-ultural immunology,1999(11):117-134.
  [26] ZHANG H Y,DUAN Z J,WANG L,et al. Hapten synthesis and development of polyclonal antibody)based multi)sulfonamide immun-oassays[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006(54):4499-4505.
  [27] 呂芳.含五元雜環磺胺類藥物單克隆抗體的制備及初步應用[D].揚州:揚州大學,2008:1-42.
  [28] SPINKS C A,WYATT G M,LEE H A,et al .Molecular modeling of hapten structure and relevance to broad specificity immunoassay of sulfonamide antibiotics[J]. Bioconjugate Chem,1999(10):583-588.
  [29] WANG S,ALLAN R D,SKERRITT J H,et al. Development of a class)specific competitive ELISA for the benzoylphenylurea insecticides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(8):3330-3338.
  [30] XU Z L,XIE G M,LI Y X,et al. Production and characterization of a broad)specificity polyclonal antibody for O,O)diethyl organophosp-horus pesticides and a quantitative structure-activity relationship study of antibody recognition[J]. Analytica Chimica Acta,2009(647):90-96

免費論文下載中心 http://www.hi138.com
下载论文

論文《農獸藥多殘留免疫分析檢測方法研究進展》其它版本

農林學類論文服務

網站聲明 | 聯系我們 | 網站地圖 | 論文下載地址 | 代寫論文 | 作者搜索 | 英文版 | 手機版 CopyRight@2008 - 2017 免費論文下載中心 京ICP备17062730号