蝦類和蟹類的過敏原組分分析

論文類別:醫藥學論文 > 臨床醫學論文
上傳時間:2011/1/31 9:47:00

       作者:毛露甜, 範紅英, 張在軍, 黃婉慧, 楊華勝, 周立斌

【摘要】   目的: 分析蝦類和蟹類的過敏原組分。方法: 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)和Western blot分析蝦類和蟹類的主要過敏原組分。結果: 不同種類的蝦其主要過敏原組分相對分子質量(Mr)在36 000附近, 不同種類的蟹主要過敏原組分Mr在29 000、 36 000、 66 000、 89 000附近。結論: 不同種類的蝦蟹存在共同過敏原。

【關鍵詞】 蝦 蟹 過敏原 免疫印跡

  過敏癥是一類常見變態反應性疾病, 近年來其發病率明顯上升。食物過敏原已成為食品安全隱患之一[1], 食物過敏是急需研究的新課題[2]。我國對食物過敏的研究和關註與國外發達國家相比有較大差距, 但隨著經濟的發展和人民生活水平的提高, 人們對過敏癥的關註和重視大為提高。蝦蟹等水產品是常見的過敏性食物[3], 在我國尤其沿海地區常見食用蝦蟹引起過敏的報道[4]。有資料顯示, 河蝦的過敏率高達39.0%, 遠高於其他種類的食物過敏[5]。近年來, 美國食品藥品管理局(FDA)和歐洲食品安全局(EFSA)都針對食品中的過敏原成分制定了相應的法規[6, 7]。本研究中, 我們分析了蝦類和蟹類的過敏原組分, 對保障人們食品安全、提高生活質量有著積極的意義。

  1 材料和方法

  1.1 材料 HRP標記羊抗人IgG購自鼎國生物公司; HRP標記羊抗人IgE購自Serotech公司; 牛血清白蛋白購自Sigma公司; 蛋白質相對分子質量(Mr)標準購自TaKaRa公司; PVDF膜購自美國Osmonics公司; 96孔酶標板購自Biomat公司; MINI PROTEAN11TM垂直板電泳儀和轉移系統購自BIORAD公司; 全自動酶標儀購自Thermo 公司, TGL16G冷凍離心機、 S53型紫外可見光分光光度計、 DYB2型脫色搖床均為上海三科公司的產品。蝦類(刀額新對蝦、 日本沼蝦、 口蝦蛄)和蟹類(中華絨螯蟹、 梭子蟹、 青蟹)購自惠州市西湖市場, 均為活品。從惠州市中心人民醫院檢驗科收集20例蝦、 蟹過敏患者的陽性血清, 等量混合組成標準血清, 采無過敏癥的健康人血清作陰性血清。分離血清並分裝後於-20℃凍存備用。

  1.2 方法

  1.2.1 蝦、 蟹過敏原浸液的制備及SDSPAGE分析 參照文獻[8]的方法略作修改, 取其肉用組織攪拌機搗碎後用預冷的丙酮去脂3次至脫脂完全為止, 待丙酮完全揮發後, 以0.01 mol/L PBS為提取液按1∶20加入蝦/蟹的丙酮粉, 置4℃冰箱冷浸過夜以提取過敏原蛋白。以12 000 r/min轉速冷凍離心20 min, 用考馬斯亮藍法進行蛋白定量後, 過濾除菌, 分裝, -20℃保存備用。將待分析的過敏原與上樣緩沖液等體積混合, 煮沸3~5 min使蛋白變性, 取適量樣品上樣, 以溴酚藍指示, 考馬斯亮藍R250染色後脫色至背景為無色為止。

  1.2.2 Western blot 分析蝦、 蟹的過敏原組分 參照文獻[9]的方法, 各種蝦蟹的蛋白經SDSPAGE分離後, 濕印跡至PVDF膜, 30 g/L BSA 4℃封閉過夜, 與相應過敏癥患者的陽性血清(1∶20)反應, 用無過敏癥的健康人血清設陰性對照。4℃孵育過夜, 洗滌後加入羊抗人IgEHRP(1∶300)二抗, 37℃孵育2 h, 用底物DAB顯色, 顯色條帶與預染的Mr標準對照, 確定其Mr。

  2 結果

  2.1 SDSPAGE分析蝦類的蛋白組分 刀額新對蝦、 日本沼蝦和口蝦蛄的蛋白浸液經SDSPAGE分析見圖1,結果顯示, 刀額新對蝦可辯條帶14條, 組分Mr分布在15 000~97 000之間, 其中主條帶有7條, Mr分別為21 000、 36 000、 38 000、 40 000、 48 000、 66800和74 700。日本沼蝦可辯條帶11條, Mr分布在14 000~97 000之間, 其中主條帶有9條, Mr分別為21 000、 25 000、 29 000、 32 000、 36 000、 44 000、 52 000、 66 800、 74 700。口蝦蛄可辯條帶12條, Mr分布在14 000~97 000之間, 其中主條帶有9條, Mr分別為15 000、 20 000、 23 000、 36 000、 38 000、 40 000、 48 000、 66 800、 89 000。

  圖1 不同蝦類蛋白浸液的SDSPAGE分析(略)

  1: 蛋白marker; 2: 刀額新對蝦; 3: 日本沼蝦; 4: 口蝦蛄.

  2.2 SDSPAGE分析蟹類的蛋白組分 中華絨螯蟹、 青蟹和梭子蟹的蛋白浸液經SDSPAGE分析, 結果如圖2所示, 中華絨螯蟹可辯條帶11條, 條帶Mr分布在20 000~90 000之間, 其中主條帶有7條, Mr分別為20 100、 29 000、 33 000、 35 000、 38 000、 49 000、 66 400。青蟹可辯條帶13條, 條帶Mr分布在14 000~90 000之間, 其中主條帶有9條, Mr分別為14 300、 20 100、 27 000、 29 000、 35 000、 38 000、 44 300、 66 800、 89 000。梭子蟹可辯條帶17條, 條帶Mr分布在15 000~90 000之間, 其中主條帶有10條, Mr分別為15 000、 19 900、 22 000、 27 000、 29 000、 38 000、 44 300、 49 000、 66 800、 89 000。

免費論文下載中心 http://www.hi138.com

  圖2 不同蟹類蛋白浸液的SDSPAGE分析(略)

  1: 蛋白marker; 2: 中華絨螯蟹; 3: 青蟹; 4: 梭子蟹.

  2.3 Western blot分析蝦類的過敏原 3種蝦的粗提液經Western blot分析, 結果見圖3。刀額新對蝦、 日本沼蝦和口蝦蛄3種浸液中的36 000的蛋白組分均可與蝦過敏患者的血清IgG和IgE結合, 說明3種蝦的主要過敏原均為36 000的蛋白組分。3種蝦的印跡膜與陰性血清反應均未顯條帶。

  2.4 Western blot分析蟹類的過敏原 3種蟹的粗提液經Western blot分析, 結果見圖4。中華絨螯蟹的印跡膜可與蟹過敏患者的陽性血清IgG和IgE結合, 主要過敏原Mr為66 000的組分; 青蟹蛋白組分中可促使機體產生IgG的蛋白質Mr分別為36 000、 89 000, 而促使IgE產生的蛋白質Mr分別為27 000、 36 000、 89 000; 梭子蟹印跡膜與蟹過敏陽性血清IgE結合的蛋白質Mr分別為36 000和89 000的組分, 而與IgG結合的蛋白質Mr分別為29 000和89 000。3種蟹的印跡膜與陰性血清反應均未見條帶。

  圖3 Western blot分析蝦類的過敏原組分(略)

  M: 蛋白marker; 1-3: 分別為刀額新對蝦、 日本沼蝦和口蝦蛄的SDSPAGE圖譜; 1a-3a: 分別為刀額新對蝦、 日本沼蝦和口蝦蛄與IgE結合的條帶; 1b-3b: 分別為刀額新對蝦、 日本沼蝦和口蝦蛄與IgG結合的條帶; 4, 5: 陰性對照試驗.

  圖4 Western blot分析蟹類的過敏原組分(略)

  M: 蛋白marker; 1-3: 分別為中華絨螯蟹、 青蟹和梭子蟹的SDSPAGE圖譜; 1a-3a: 分別為中華絨螯蟹、 青蟹和梭子蟹與IgE結合的條帶; 1b-3b: 分別為中華絨螯蟹、 青蟹和梭子蟹與IgG結合的條帶; 4, 5: 陰性對照試驗.

  3 討論
  
  蝦的蛋白質組成均存在一定差異, 在Mr為36 000附近, 本研究中的這3種蝦均出現了明顯條帶, 這與李振興等[10]報道的結果基本一致, 部分結果有差異可能是蝦蟹和人的種屬差異引起的。Mr 36 000的組分也是國外報道的最可能引起過敏的蝦類過敏原——原肌球蛋白, 超過84%的蝦過敏癥患者血清能與其發生作用。本研究結果顯示, 即使屬於不同的目(十足目和口足目), 蝦的主要過敏原沒有明顯變化, 這與原肌球蛋白在肌原纖維中最穩定的特性相吻合。
  
  本實驗中分析的3種蟹都為十足目但屬於不同科, 其過敏原Mr分布在29 000~89 000之間, 主要過敏原Mr為36 000和89 000的蛋白組分。可見蝦與蟹作為甲殼類水產品具有共同的過敏原, 這與Martinez等[11]報道的原肌球蛋白是無脊椎動物的主要過敏原並且相互之間存在嚴重交叉反應的結論相吻合。

參考文獻


  [1] Dearman RJ, Kimber I. Food allergy: what are the issues?[J]. Toxicol Lett, 2001,120 (1-3): 165-170.

  [2] Malarkey T. Human health concerns with GM crops[J]. Mutat Research, 2003, 544(2-3): 217-221.

  [3] Schafer T, Bohler E, Ruhdorfer S, et al. Epidemiology of food allergy/food intolerance in adults: associations with other manifestations of atopy[J]. Allergy, 2001, 56(12): 1172-1179.

  [4] 伍秋容. 廣州地區不同年齡組過敏性疾病患者的致敏原分布特性分析[J]. 華南預防醫學, 2005, 31(2): 60-62.

  [5] Liang GZ, Li FJ, Hou SB, et al. Analysis of allergens of allergosis in 1625 cases[J]. Pract Clin Med, 2005, 6(7): 14-16.

  [6] Rene C. Allergens: the European approach[J]. J Food Sci, 2004, 69(4): 343-346.

  [7] Vierk K, Falci K, Wolyniak C, et al. Recalls of foods containing undeclared allergens reported to the US food and drug administration, fiscal year 1999[J]. J Allergey Clin Immunol, 2002, 109(6): 1022-1026.

  [8] 趙綺華, 王錫忠, 陳麗金, 等. 梭子蟹變應原的分離、 純化與鑒定[J]. 中國免疫學雜誌, 2007, 23(3): 256-259.

  [9] 張紅雲, 宋娟娟, 劉誌剛, 等. 荔枝果實中profilin的表達純化及其與樺樹花粉Bet v 2的交叉反應性研究[J]. 免疫學雜誌, 2007, 23(5): 541-544.

  [10] 李振興, 林 洪, 李明華, 等. 不同蝦類的過敏原及其過敏原性[J]. 水產學報, 2006, 30(2): 281-284.

  [11] Martinez A, Martinez J, Palacios R, et al. Important of tropomyosin in the allergy to household arthropods, crossreactivity with other invertebrate extracts[J]. J Allergy Immunol, 1997, 25(3): 118-126.

免費論文下載中心 http://www.hi138.com
下载论文

論文《蝦類和蟹類的過敏原組分分析》其它版本

臨床醫學論文服務

網站聲明 | 聯系我們 | 網站地圖 | 論文下載地址 | 代寫論文 | 作者搜索 | 英文版 | 手機版 CopyRight@2008 - 2014 免費論文下載中心 沪ICP备14015432号-2