IL18基因啟動子區607C/A位點多態性與痛風發病有關性

論文類別:醫藥學論文 > 醫學論文
上傳時間:2012/3/25 11:11:00

          作者:王新凤 袁鷹 李長贵 劉世國

【摘要】 目的 探討山東漢族人白細胞介素18(IL18)基因啟動子区607C/A位点單核苷酸多態性與痛風易感性之間的關系。方法 應用聚合酶鏈反应序列特異性引物技術,檢測100例痛風病人和100例非痛風病人IL18基因啟动子區607C/A單核苷酸多態性位點的基因型。结果 非痛風病人和痛風病人IL18基因啟動子區607C/A位點3种基因型頻率分別為:AA型0.18(18/100)、0.18(18/100),AC型0.58(58/100)、0.67(67/100),CC型0.24(24/100)、0.15(15/100)。IL18基因啟动子區607C/A位点的基因型和等位基因頻率在兩組之間分布無明顯差異。結論 山東漢族人群中IL18基因啟動子區607C/A位點存在多態性,但痛風與该多態性無相關性。
【关鍵詞】 痛風;白細胞介素18;多态性,單核苷酸
[ABSTRACT] Objective To investigate the mononucleotide polymorphism (SNP) at position607 at the promoter region of interleukin18 (IL18) gene for the association with gout in Chinese Han population of Shandong province. Methods The polymorphism of promoter region in the IL18 gene (607C/A) was studied in 100 gout patients and 100 nongout controls by using sequencespecific primers polymerase chain reaction (PCRSSP) and sequencing. Results The frequency of AA genotype in IL18607C/A was 0.18 (18/100) in normal controls and 0.18 (18/100) in patients. The frequency of AC genotype was 0.58 (58/100) in normal controls and 0.67 (67/100) in the patients. The frequency of CC genotype was 0.24 (24/100) in nongout group and0.15 (15/100) in gout group. There was no significant difference in terms of the frequencies of alleles and genotype of IL18607C/A between the two groups. Conclusion IL18607C/A polymorphism exists in Chinese Han population of Shandong province. However, there is no relationship for polymorphism of IL18607C/A between gout group and nongout group.
  [KEY WORDS] gout; interleukin18; polymorphism, single nucleotide
  痛風是由於嘌呤代謝紊亂导致血尿酸增高而引起组織損傷的一組疾病,是由遺傳性和獲得性引起的尿酸排泄減少和嘌呤代謝障碍。隨著經濟的發展和生活水平的提高,原發性痛風患病率明顯增高。原發性痛风發病機制復雜,涉及分子生物學、遺傳學等諸多領域。 研究證實痛風發作時滑膜細胞分泌一系列的炎癥因子,導致炎癥細胞的浸润,引起組織結構的破壞及功能的障礙。已有研究顯示,白細胞介素18(IL18)作為一種前炎癥因子,在痛風性关節炎急性發作時血清中的水平較對照組明显升高[1]。IL18是IL1超家族成員,其功能復雜。IL18最初被命名為“IFNγ誘生因子”,具有與IL12相似的生物學活性,增強T和NK細胞成熟、產生細胞因子及發揮細胞毒性作用。 它位於11號染色體長臂,由6個外顯子和5個内含子組成,其中位於第一外顯子上遊315~1 357 bp的區域對IL18的表達具有重要的調控作用。本研究應用聚合酶鏈反應序列特異性引物(PCRSSP)技術檢測IL18基因單核苷酸多態性(SNP),從而探討IL18 基因啟動子區607位點SNP與痛風易感性之間的關系。
  1 資料與方法
  1.1 一般資料
  痛風病人來源於2008年7月—2009年1月青島大學醫學院附屬醫院門診和住院痛風病人及山東沿海地區流行病學調查收集的原發性痛風病人共100例,全部為男性病人,平均年齡54.6歲。均符合1997年美国風濕病協會制定的诊斷標準,並排除有腎衰竭、腫瘤和其他自身免疫性疾病者。對照組為隨機選取的青島及山東沿海地區無血緣關系的非痛風男性病人100例,平均年齡49.0歲。
  1.2 研究方法
  1.2.1 基因組DNA的提取 兩組病人均於清晨空腹采集靜脈血4 mL,EDTA抗凝。按標準的酚氯仿法抽提DNA,所有DNA樣本置-20 ℃保存。
  1.2.2 PCR引物設计與合成 根據IL18 基因啟動子607C/A位点多態性和已知的DNA序列,參照文獻[2]設計 PCR引物(表 1),由上海生工生物技術有限公司合成。其中特異性引物的3′端堿基根據多態性序列與其嚴格互補,通過特定的PCR反應体系擴增各等位基因的特異性DNA片段,產生相對應的特异性擴增條帶;而內參照引物扩增包含有特異性突变位點的DNA片段,用於判定整個PCR體系的成功與否。表1 IL18基因啟动子607位點序列特異引物引物序列長度(bp)上遊引物5′
  1.2.3 PCR反应體系及反應參數 PCR擴增體系總体積為25 μL,包括:Taq 酶2 U,10×PCR緩沖液(Mg2+plus)2.5 μL,dNTP 2.5 mmol/L,基因組DNA 100 ng,IL18基因上下遊引物各1 μmol/L,陽性內對照引物1 μmol/L,不足部分用雙蒸水補足。PCR扩反應增條件:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,15個循環;然後94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共15個循環;最後72 ℃延伸7 min。每次PCR反應均設陽性、陰性和空白對照(100 bp DNA Ladder Marker作為分子質量標準)。每份樣本的PCR擴增產物在溴化乙錠染色的15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳,紫外線灯下觀察結果,自動凝膠成像分析系統進行成像和分析。
  1.2.4 序列分析 為驗證PCRSSP反應結果的準確性,在兩組的各基因型中隨機選取样本共12份,用內參照引物進行PCR擴增後送北京三博遠誌公司進行序列測定。
  1.3 統計学處理
  兩組IL18基因位點的群體代表性采用HardyWeinberg遺傳平衡定律检驗。基因型和等位基因频率在兩組中的分布差異采用χ2檢驗,在SPSS 13.0軟件包上進行統计學處理。
  2 結 果
  2.1 IL18基因啟動子607C/A位點多态性檢測
  IL18基因啟動子607C/A多態性位點PCR扩增產物經瓊脂糖凝膠電泳,出現一條長301 bp陽性對照帶和一條長196 bp條帶。其位點的多態性分為3種基因型:AA型、CC型和AC型(圖1)。隨機抽取的3種基因型擴增產物的測序结果與瓊脂糖凝膠基因分型的結果相符(图2)。
  2.2 兩組IL18基因啟動子607C/A位點多態性的比較
  對照組的IL18基因啟動子607C/A基因型頻率和等位基因頻率分布符合HardyWeinberg平衡(P>0.05),具有群體代表性。在對照組中,基因型頻率分布以AC型最為多見,CC型最為少见,AA型居中。等位基因频率以C等位基因最為多見。IL18基因啟動子607C/A位点的基因型和等位基因频率分布在兩組之間無明顯差别。見表2。
  3 討 論
  原發性痛風是一種嘌呤代謝紊亂性疾病,是由表2 两組IL18基因啟動子607C/A位點基因型和等位基因頻率的分布(例)组別n等位基因AC基因型AAACCC痛風組10010397186715對照組10094106185824
  遺傳背景与環境因素共同作用導致的疾病[3]。臨床特點為高尿酸血癥及由此引起的急性關節炎反復發作、痛風石沈積、痛風石性慢性關節炎和關節畸形,痛风結晶沈積在腎臟可引起間质性腎病和腎結石。本病发病機制復雜,涉及尿酸生成、排泄等領域,目前除了確定少數由於酶缺陷引起外,大多機制未闡明。由於本病是一種炎症性疾病,因此所有參与痛風炎癥反應過程的基因位點可能都是痛風的易感基因。有研究显示,痛風性關節炎發作時血清中IL18的水平較對照組增高。
  IL18是一种前炎癥因子,功能眾多。能夠誘导IFNγ的產生,被命名為IFNγ誘生因子;能增加NK細胞和Th1細胞的細胞毒作用,從而促进Th1型免疫反應,並且它自身還能介導T細胞和NK細胞分泌IL4、IL5、IL10和IL13等炎癥因子,並能促進中性粒細胞的聚集[46]。
  編碼IL18的基因位於人類第11號染色體11q22.2q22.3 上,在众多的多態性位點中研究最多的是启動子607、137兩个SNP位點。研究顯示,607C/A和137G/C能影響IL18基因啟動子活性[2]。607位點由C變為A阻斷cAMP 應答元件結合蛋白(CREB) 結合位點,從而抑制受CRE 調控的基因轉录。137位點由G變為C 改變核因子H4 TF21 的結合位點,阻斷受H4 TF21 調控的基因轉錄。因此,等位基因607C和137G表達蛋白水平較高。許多疾病的發生都與IL18有關,如病毒感染性疾病、自身免疫性疾病。ZHANG 等[7]分析IL18基因啟動子區607 和137位點SNP 与漢族人慢性乙型肝炎的關系,結果显示慢性乙型肝炎病人607C/137C 和607A/137C 單倍体分布頻率明顯低於對照組。HIROMATSU等[8]的研究結果顯示,IL18基因啟動子區4675位GG基因型或4675 G/607A/137G單體型可能是患GRAVES病的保護性基因。最近,類風濕性關節炎與IL18基因SNP的關系备受關註。有研究顯示,IL18607AA基因對類風濕性关節炎的發展有保護性作用。但PAWLIK等[9]對波蘭人的研究顯示,IL18與該疾病的嚴重程度沒有相關性。另有研究結果顯示,在腎上腺皮质和非肥胖糖尿病小鼠的胰腺IL18 mRNA也有表達[1011]。因此,IL18除了具有免疫系統的功能外,可能與其他的生理系統如內分泌和神經系統有關。痛風性關節炎不僅是一種代謝性疾病也是一種炎癥性疾病,因此,研究IL18基因SNP与痛風性關節炎易感性的关系有重要意義。

免费論文下載中心 http://www.hi138.com   本研究結果顯示,IL18基因607C/A位点等位基因頻率與對照組相比差別無統計學意義;3種基因型頻率分布也無統計學意義。但是,是否IL18基因啟動子區多態性與痛風發病有關聯還不能下定論。首先,所有編碼IL18基因存在多種SNP位點,由於受多種原因的影響目前研究最多的是啟動子區607、137兩个位點,其他位點的SNP与IL18表達量及痛風發病易感性的關系還沒有確定。其次,不同國家、不同種族、不同地區在遺傳背景方面存在著差異。本研究初步證明,中國漢族人存在的IL18基因外顯子1上遊607C/A位點多態性與痛風的易感性之間可能沒有關系,但由於受樣本量的限制,仍然有必要擴大样本量進一步研究。再次,原發性痛風是一種多基因遺傳疾病,遺傳背景復雜,在遺传模式上表現為以微效基因為主的主效、中效和微效基因多種形式並存。即使單個SNP位點改變與痛風發病有相關性,也需要將多個SNP位點結合起来組成一個單倍型進行分析研究。
  綜上所述,山東漢族人群IL18基因啟動子607C/A位點SNP可能和痛風的發病無關,但鑒於IL18基因啟動子區仍有多個SNP位點本實驗未涉及,同時IL18有眾多的生物學作用,找到影响IL18活性的基因位點將為以後基因治療提供靶目標。因此,有必要對此作進一步研究。

參考文獻


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