卵黃抗體用於血吸蟲循環抗原檢測的可行性分析

論文類別:醫藥學論文 > 醫學論文
上傳時間:2012-4-27 10:30:00

                 作者:吳玉龍 張炜明 劉文琪 仇鎮寧 馮振卿 李雍龍 管曉虹

【摘要】 目的 探討抗可溶性蟲卵抗原(SEA)雞卵黄抗體(Immunoglobulin Y, IgY)用於血吸蟲循環抗原檢測的可行性。方法 以純化的雞抗SEA卵黃抗體為捕捉抗体,以酶標抗SEA單克隆抗體NP285B進行雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗法(SELISA)檢測急、慢性血吸蟲病病人和健康人血清,並與常規檢测抗體的酶聯免疫吸附試驗(SEAELISA)法做比較。結果 SELISA法測得SEA濃度(y)與A450值(x)呈明顯的正相關(r=0.9481,y=459.22x-108.14);SELISA法檢測急性血吸蟲病人循環抗原的陽性率為100%,慢性血吸蟲病人循環抗原的陽性率為84.4%,健康人的特異性為96.0%;兩種方法對血吸蟲病的檢出率差異無統計学意義(P>0.05)。結論 SELISA可用於血吸蟲病的免疫診斷。
【關键詞】 血吸蟲;免疫診斷;循環抗原;卵黃抗體
  【Abstract】 Objective To analyze the feasibility on detection of circulating schistosome antigen with antiSEA chicken immunoglobulin Y(IgY).Methods Using chicken antiSEA IgY as the captureantibody and an antiSEA mouse mAb conjugated with HRP as the detection antibody, a sandwich ELISA technique was established to detect the circulating schistosome antigen in serum samples of patients with acute, chronic schistosomiasis and healthy people. The results were compared with those of SEAELISA. Results There was an obviously positive correlation between SEA concentration and A450 value. The regression equation was deduced (r=0.9481,y=459.22x-108.14). The positive rates of SELISA for testing acute, chronic schistosomiasis patients were 100% and 84.4%, respectively.The specificity of healthy people was 96.0%. No significant difference was observed between the two ELISA methods.Conclusion SELISA could be used in immunodiagnosis of schistosomiasis.
  【Key words】 schistosome,immunodiagnosis,circulating antigen,egg yolk antibody
  血吸蟲病是一种嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。研究高度特異和敏感的既有診斷價值又有療效考核價值的循環抗原檢測方法仍是當前血吸蟲病應用基礎研究的重要內容[1]。特定的抗原免疫產蛋母雞后,可產生相應的抗體轉移和積累於蛋黃中,從蛋黃中提取的抗體雞卵黃抗體(IgY)。IgY因其生物學特性和制备上的優勢,正在成為生物技術和醫藥研究領域的热點[2,3]。本研究應用抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)多克隆卵黃抗體和酶標單克隆抗體組合建立一種雙抗體夾心法來檢測血吸蟲循環抗原,以分析卵黃抗體用于血吸蟲病診斷的可行性。
  1 材料与方法
  1.1 抗體制備及酶標記 取60 μg SEA與等體積的福氏完全佐剂混合經翅膀下靜脈免疫海兰蛋雞,首次免疫7 d後開始收集雞蛋。取卵黃與蒸餾水按1∶9比例充分搅拌混勻,置4℃過夜,靜置分層取上清4℃ 10 000 r/min離心25 min,取上清加入19%硫酸鈉,45℃水浴中充分搅拌溶解,再離心,用适量蒸餾水溶解沈澱置透析袋中4℃透析過夜,收集分裝後置-20℃保存備用;復蘇本實驗室保留的NP285B阳性雜交瘤細胞株,傳代培养後收集培養細胞上清,用50%飽和硫酸銨沈澱後,溶解於0.01M,pH7.4的PBS,充分透析後放置-70℃冰箱備用。經免疫雙擴散鑒定,NP285B的同型為IgG1,其靶抗原分子量为140 kD。 采用簡易过碘酸鈉法,將辣根過氧化物酶(HRP, RZ≥3.0, 批號20080219)結合至NP285B上,經滴定確定其工作濃度為1∶600~1∶1 000。
  1.2 檢測血清來源 急性血吸蟲感染病人血清9份和慢性感染病人血清45份分別采自江西九江都昌縣血防所和雲南省大理白族自治州巍山縣鼠街鄉鼠街村。正常人血清50份取自山東省濱州市門诊病人。
  1.3 SELISA 检測方法的建立 將IgY溶於pH9.6、0.1 mol/L碳酸鹽缓沖液中,以此液100 μl包被ELISA 反應孔中,4℃過夜;次日甩幹孔中液體,PBST液洗滌3次,用10% 的脫脂牛奶37℃封閉2 h,PBST液洗滌3次;加入1∶100 稀釋的待測血清100 μl,37℃ 孵育後,PBST液洗滌3次;加入稀释好的HRPNP285B 100 μl 37℃ 孵育,PBST液洗滌6~10次,采用TMB/H2O2顯色方法,37℃ 下避光顯色10 min後,每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4 終止顯色反應,450 nm波長處測定吸光值(A450)。每板均設陽性对照和陰性對照,以A值≥陰性对照的2.1倍作為陽性判定標準。通過正交試验來確定最佳檢測條件,選用L12(211)正交表,設立4個實验因素,每因素設2個水平,分別為:IgY包被濃度(5 μg/ml,10 μg/ml )、血清孵育時間(60 min,30 min)、酶標抗體濃度(1∶600,1∶1 000)和酶標抗體孵育時間(45 min,30 min)。
  1.4 統計學分析 采用χ2檢驗對SELISA法和SEAELISA法檢測的敏感性與特異性進行兩兩比較。
  2 结果
  2.1 正交試驗結果 使用上述正交表对4個實驗因素的各個水平進行條件組合(表1),每一組合條件下,都檢測同一份陽性參考血清和陰性參考血清,每个組合實驗重復3次。陽性參考血清與陰性參考血清A450差值越大,則表明該組合所对應的檢測水平是最佳。最终確定的檢測條件為:包被濃度1∶2 000、血清孵育時間為60 min、酶標抗體濃度为1∶1 000、酶標抗體孵育時間為30 min。
  2.2 SELISA法檢測血吸蟲病病人血清循環抗原的敏感性與特異性 用SELISA法和SEAELISA法分別檢測急性血吸蟲感染病人血清9份,慢性血吸蟲病人血清45份,所得陽性率分別為100%、84.4%和100%、95.6%;非感染區正常人血清50份,特異性分别為96%、94%。如表2所示,χ2檢驗分析兩種方法檢測血吸蟲病人血清的敏感性與特异性差異均無統計學意義(P>0.05)。表1 正交設计確定的檢測條件實驗號IgY包被濃度表2 SELISA和SEAELISA法檢測血吸蟲病人和正常人结果
  2.3 循環抗原的量化檢測 將SEA 標準抗原(90 μg/ml)溶於1∶100 稀釋的正常人血清中配成不同濃度系列(22.5~900 ng/ml)作為待測標本,每一濃度重復3孔;將SELISA 檢測SEA 所得的 A450 均值與對應的濃度繪圖,圖1所示各點呈現直線趨勢,计算得到直線回歸方程為:y=459.22x-108.14,r=0.9481,表明抗原濃度與吸光度值之間呈明顯的正相關。

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  血吸蟲循環抗原的檢測可區分現癥感染和既往感染,可作為療效考核指標。建立高敏感性的循環抗原檢測方法是當前血吸蟲病防治中亟待解決的問題之一。現有的血吸虫循環抗原檢測方法敏感性還有待提高,尤其是在慢性感染者。其原因可能是因為循環抗原多为血吸蟲的代謝分泌物,易受到機體免疫系統的清除,從而導致循環抗原在血清中含量不高,特別是在一些低感染或慢性感染者[4,5]。此外,獨特性抗體的存在也能影響到循環抗原的檢測。近年來,研究者們都在致力於提高血吸蟲循環抗原檢测的敏感性與特異性[68]。本研究利用抗SEA的雞卵黃抗體作為捕獲抗體、酶標抗SEA單克隆抗體NP285B的夾心ELISA法對9例急性血吸蟲感染病人血清和45例慢性感染病人血清進行檢測,結果显示急慢性血吸蟲感染病人循環抗原檢測的陽性率為100%和84.4%。50份非疫區正常人檢測的特異性達96.0%。統計分析結果表明本研究所建立的雙抗体夾心法對急、慢性血吸虫病的檢出率與經典的抗體法(SEAELISA)檢測結果相似。有人應用從重感染兔血清中提取的γ球蛋白為捕捉抗體、酶標NP285B為检測抗體的雙夾心ELISA檢測慢性日本血吸蟲病患者循環抗原的陽性率為88.2%[6],本研究结果與此基本一致。表明本法检測循環抗原具有較好的敏感性與特異性。
  卵黃抗体IgY是產蛋母雞受到特異性抗原的免疫刺激後,由血清中產生相應的特異性抗體转移至卵黃中蓄積而成的多克隆抗體。從卵黃中提取的IgY純度高、含量大、制備及純化技術簡單成熟。由於雞与哺乳動物種系發生學關系較遠,IgY還具有一些不同於哺乳动物IgG的特點[9,10]:不與血清中的類風濕因子(RF)結合,不激活哺乳動物補體系統,也不與Fc受體結合,將IgY應用於免疫診斷中,可減少假陽性的出現,從而提高檢測的特異性。
  本研究所建立血吸蟲循環抗原檢測方法采用多抗與单抗夾心的檢測模式,從理論上分析,多抗針對抗原的位點多,用作捕捉抗體可以提高檢測的敏感性;而單抗針對抗原的位點单一,用作檢測抗體則可以提高檢測的特異性。此外,用正交實驗對所建立的双夾心ELISA法分别從4個實驗因素2水平進行分析從而確定最佳的检測條件。從各組檢測條件组合中選取陽性參考血清與陰性參考血清A450差值最大的組合作為最终檢測的條件。如用普通的排列组合,則需要進行16次实驗,而應用正交設計實驗则可減少實驗次數,提高實驗效率。
  作為一种制備簡便而又經濟的抗體技术,卵黃抗體技術有望成為制備動物多克隆抗體的一種常規的優良的替代技術,其在醫学上的應用正深受越來越多研究者的重視,有進一步研究和推廣的價值。
  为增加試驗結果的可信性,進一步验證本研究所建立的檢測方法在血吸虫病診斷中應用的可行性及應用價值,下一步我們将擴大檢測範圍,進行進一步的實驗,收集更多的數據,以利於方法的改進。  

參考文獻


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